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ChromoTek 常見問題解答
樂博生物 / 2012-07-11
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1、GFP-Trap®可識別的GFP衍生物類型有哪些?

    (1) eGFP, wtGFP, GFP S65T

(2) TagGFP

(3) eYFP, YFP, Venus, Citrin

(4) CFP

不能識別:TurboGFP所有的RFPs

 

2、RFP-Trap®可識別的RFP衍生物類型有哪些?

(1) mRFP

(2) mCherry

(3) mOrange

(4) mPlum

(5) mRuby

(6) mKate2

    不能識別:DsRedmRFPrubyTagRFP、所有GFPs

 

3、Nano-Trap® (GFP-Trap® / RFP-Trap®的結合能力如何?

    Nano-Trap®的結合能力取決于珠子。每10μL漿液,瓊脂糖珠可結合2~3μg GFP,磁性顆粒可結合0.25-~0.5μg GFP。

 

4、可以從GFP-Trap洗脫結合蛋白么?

    關于定量洗脫,可以將樣品至于SDS上樣緩沖液中95℃煮10min(詳見protocol),或者在0.2 M的甘氨酸(pH2.5)中孵化0.5~2min,隨后用0.1體積的1M Tris堿中和。


5、是否可以從GFP-Trap洗脫出自然狀態的結合蛋白,比如,在凝膠遷移實驗或功能分析實驗中?

    可以嘗試洗脫游離的GFP。但是,請注意,這種方法,不能定量洗脫出目標融合蛋白。

 

6、怎樣才能避免非特異性的蛋白與GFP-Trap交互作用而結合?

    關鍵操作步驟,是在孵化液中稀釋洗滌劑的濃度。我們建議,洗滌劑為終濃度0.1%(如NP-40 TX-100),且最終體積不少于0.4mL。另外,我們建議,要測定各種洗滌緩沖液的鹽濃度,使其范圍在150mM-500mM范圍內,以去除非特異性結合的親水性蛋白。


7、在binding過程中,N-端與C-GFP融合蛋白之間是否存在差異?

    GFP-Trap®C-末端的GFP融合蛋白的親和力稍高,若要消除這種差異,可以加長孵化時間(1-2h取代15-30min

 

8、是否可以在組織樣品(即變性緩沖液)中直接純化GFP標記的融合蛋白?

    原則上,GFP-Trap®即使在惡劣的緩沖條件下(如,RIPA緩沖液,含0.1%SDS1M尿素),也非常穩定。

 

9、可結合的GFP-Trap®珠的GFP結構,是否有大小限制?

    無。

 

10、如果在洗脫液中,有剩余的背景怎么辦?

    建議使用Chromotekblocked particlesbab-20 or bmp-20)對樣品進行預處理。

 

 

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