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德國ChromoTek公司GFP trap和booster實驗操作說明!北京樂博生物,優勢代理!
lebo / 2015-10-12
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德國ChromoTek公司GFP trap和booster實驗操作說明!北京樂博生物,優勢代理!

 

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使用 GFP-Trap®_A GFP 融合蛋白如何進行免疫沉淀實驗

 

收集細胞以下以一個免疫沉淀反應使用 ~ 106-107  的哺乳動物細胞 約一個 10 厘米培養皿 達綠色熒光蛋白標記蛋白為例。收獲貼壁細胞、 吸出生長培養基、 向培養皿中加入 1 毫升預冷 的 PBS 并刮取細胞。細胞轉移到一個預冷卻的管子 在 500 g + 4°C 時的 離心 3 分鐘并丟 棄上清液。用冰的 PBS 洗兩次輕輕重新懸浮細胞塊的細胞團。洗滌后進入下一步

 

Lyse cells:細胞裂解 

1、用移液器或使用注射器在 200 μ l 冰冷的裂解緩沖液重懸細胞顆粒。注意 在裂解緩沖液中 加入蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF 用戶自備。對于核/染色質蛋白可采用以下方案 使用 RIPA中加入 1mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2自備.

2、每充分吹打 10 分鐘把管子放置在冰上 30 分鐘。 

3、細胞裂解液 20.000 x g + 4 °C 離心 10 分鐘。轉移裂解產物到一個預冷管中。向裂解液中加入稀 釋緩沖液 300ul。丟棄顆粒。 

注意 此時 細胞裂解液可以放在 -80 °C  進行長期儲存。 

可選 向稀釋緩沖中加入蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF 用戶自備

Equilibrate beads平衡 beads 

4、振蕩混勻 GFP-Trap®_A beads吸取 25 μ l bead  500 μ l 冰冷的稀釋緩沖液中。離心 2.500 x g 2 分鐘 + 4 °C。丟棄上清液和重復洗 2 次。

Bind proteins結合蛋白 

5. 將步驟 3 得到的稀釋的裂解液加入到步驟 4 得到的平衡的 GFP -Trap®_A beads 中。如果需要 保存 50 ul 的稀釋裂解液進行免疫印跡分析。 4°C 翻滾振蕩 1 小時。 

6. 2.500 x g + 4 °C 離心 2 分鐘。如果需要保存 50 ul 上清液進行免疫印跡分析。丟棄其余的上清液。 

Wash beads 清洗 beads 

7. 500 μ l 冰冷稀釋緩沖液中重懸 GFP-Trap®_A beads。 在 2.500 x g + 4 °C 離心 2 分鐘。丟棄 上清液和重復洗 2 次。 

optional : Increase salt concentration in the second washing step up to 500 mM. 

可選在第二次洗的步驟中增加鹽的濃度到 500 mM

 

Elute proteins洗脫蛋白

 

方案一用于 western blot所有含 GFP 熒光標記的重組蛋白都會進行本步定量和鑒定實驗 

8. 100 μl 2x SDS -sample buffer 中重懸 GFP -Trap ®_A beads 

9. 煮沸重懸的 GFP -Trap® _A beads 在 95°C10 min 條件下把免疫復合物從綠色熒光蛋白中游 離出來。GFP -Trap®_A beads 能通過 2.500 x g 在 4 °C 離心 2 分鐘進行收集收集的產物上清 液可以進行 SDS –PAGE 

方案二用于 western blot所有含 GFP 熒光標記的重組蛋白都會進行本步定量和鑒定實驗 

10. 替代步驟 8 和 9 的可選步驟 洗脫綁定的蛋白加入 50 μl 0.2M 甘氨酸 pH 值 2.5 (孵育時 30 秒,恒定混勻), 隨后離心。轉移上清液到新管中為了中和添加 5 μl  1 M TrispH 值10.4。為了提高洗脫效率可以重復這一步。 

方案三如需進行檢測 GFP-融合酶的活性檢測無需洗脫單獨可以直接檢測。 

方案四如要進行 CHIP 實驗主要用于含有 GFP 熒光的重組蛋白的蛋白質/DNA 相互作用的實驗。 染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定染色質斷裂染色質免疫沉淀交聯反應的逆轉DNA的純化以及 DNA 的鑒定。其中第一步細胞固定染色質斷裂不變染色質免疫沉淀則直接進 入說明書的第 5 步加入的是 DNA-蛋白復合物結合到 GFP -Trap ®_A beads。進入第 6 步第 7分離得到復合物進入第 10 步得到洗脫的復合物后期交聯反應的逆轉DNA 的純化以 及 DNA 的鑒定同普通的 CHIP 實驗。 

方案五pulldown 實驗: 體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用。用于驗證兩個已知蛋白的相互 作用或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。兩個已知蛋白的相互作用一個蛋白是 GFP 融 合蛋白另一個蛋白為 FLAG 標簽的融合蛋白在第 5 步同時加入兩者其他步驟不變。進入第 10 得到洗脫的復合物同時進行 GFP  FLAG  western blot 實驗。篩選與已知蛋白相互作 用的未知蛋白操作同免疫沉淀法第 10 步得到洗脫的復合物然后進行后期質譜檢測。 

方案五Co-IP 實驗: 體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用。當細胞在非變性條件下被裂解時完整細胞內存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留了下來。用于驗證兩個已知蛋白的相互 作用或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。采用免疫沉淀對象蛋白為 GFP-目的蛋白結合 的融合蛋白與之相結合的蛋白質 Y 也被沉淀下來從而達到吸附蛋白質-蛋白質復合物的目的。 沉淀下來的蛋白質復合物采用 SDS-Page 跑膠western blot 進行鑒定也可以選擇用得到的樣品利用質譜進行后續分析。

 

 

GFP Booster 實驗操作 

1.固定 接種于蓋玻片的細胞用的 3.7%甲醛溶于 PBS固定室溫下 10 分鐘。 

2. 用含有 0.1%吐溫 20 的 PBS (PBST)清洗樣品三次。 

3.穿透 添加含 0.5%的 Triton X 100 PBS到樣品并溫育 5 分鐘室溫下。或者通透細胞 在 100%甲醇中溫育樣品 5 分鐘--20°C 

4.用 PBST 清洗樣品兩次。 

5.封閉 PBST 中添加 4 % BSA 加入到樣品中室溫溫育 10 分鐘。 

6. GFP-Booster 溫育 blocking 緩沖液中加入 200 倍稀釋的 GFP-Booster室溫溫育 1 小時。 

7.用 PBST 清洗樣品三次每次洗 5-10min。 8.如果需要的話用 DNA 熒光染料染色如 DAPI 

9.安裝在水中快速沖洗樣品以防止鹽晶體的形成。按照蓋玻片。經熒光抗體染色的標本需要 在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢以防熒光消退影響結果。

 

 

 

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